Активация клеточных протоонкогенов в онкогены

нии в ДНК опухолевых клеток онкогенных факторов и об их отсутствии в клетках нормальных.

Первые указания на присутствие в опухолевых ДНК онкогенно-активных последовательностей были получены в опытах по изучению чувствительности биологической активности ДНК к обработке сайтспецифическими эндонуклеазами [Lane M. et al. , 1981; Shilo В. , Weinberg R. _f 1981].

С. Tabin и соавт. (1982) провели генетическое картирование функционально измененной области онкогена. Для этого они осуществили in vitro гомологичную рекомбинацию между клонами двух генов. Эксперимент предусматривал иссечение рестрикцион-ного фрагмента из онкогена и использование его для замены гомологичного блока протоонкогена. Одновременно реципрокная конструкция была создана путем сплайсинга фрагмента протоонкогена в онкоген. Полученные рекомбинантные модели были затем испытаны на трансфекцию. Онкогенная активность гена EJ была обнаружена во фрагменте, состоящем из 350 нуклеотидов. Указанная область распространялась от первого Хгпа I эндонуклеазного сайта до сайта Крп I.
55 % данной области состоит из первого кодирующего экзона, 10 % — из 5'-конца до кодирующей области и 35 % является частью первого интрона.

Разница между 350-нуклеотидными сегментами ДНК нормальных и опухолевых клеток находилась в области первого экзона, кодирующего белок р21, на расстоянии 60 нуклеотидов от сайта расщепления Хгпа I, в триплете, кодирующем глицин в нормальном крысином и человеческом c-Ha-ras-генах. Гомологичная последовательность в онкогене EJ кодировала не глицин, а валин. Именно эта замена глицина была ответственной за изменение функции продукта онкогена, белка р21.

Другим независимым следствием замены единственного основания в протоонкогене было изменение в сайтах расщепления двух различных эндонуклеаз. Последовательность ГЦЦГТЦ содержится в протоонкогене и представляет сайт распознавания эндонуклеазы Nae I. Она имеет также сайт распознавания ЦЦГГ, специфичный для эндонуклеазы Нра II. Оба этих сайта изменяются в онкогене на последовательность ГЦЦГТЦ, нераспознаваемую указанными ферментами.

Замена глицина на валин в белке р21 имеет явно критическое значение для функции белка, причем, по-видимому, дело не столько в появлении валина, сколько в исчезновении глицина. Действительно, анализ, например, продукта онкогена вируса саркомы Харвея показал его отличие от продукта гомологичного нормального клеточного гена лишь в одной аминокислоте: вместо глицина в нем находится аргинин. В белке, кодируемом онкогеном вируса саркомы Кирстена, в аналогичной позиции находится серии. Следовательно, независимо от характера аминокислоты, заменяющей глицин в белке р21, последний проявляет онкогенные свойства. Все сводится к замене глицина как такового. Чем же отличается